研究背景
肾脏发育是通过两个主要组织的相互作用进行的，上皮输尿管芽反复分支，最终形成肾的收集管和输尿管，负责将尿液输送至膀胱。反过来，输尿管末端诱导间充质干细胞形成肾单位。成熟的肾单位通过过滤血液及重吸收营养物质产生尿液。近年来，对肾单位祖细胞的了解已经取得了相当大的进展，相比之下，对于上皮尿道芽（Uretericbud,UB）的起源却了解的比较少。
上皮尿道芽来源于前中肾的主要组分-肾导管（nephricduct,ND）。原始肾脏起源于中期妊娠胚胎的中胚层细胞形成的上皮导管，上皮导管通过细胞集体迁移24小时以上到达泄殖腔并与泄殖腔融合而延长。在导管延长过程中，利用ND信号在相邻的中胚层诱导出中肾小管。这些小管是原始的肾单位。因此，输尿管芽来源于肾小管和肾小管来源于中间中胚层的顺序在形态学上已经确定，但是参与这一过程的细胞的同一性和异质性目前尚不清楚。
研究思路
图1：研究思路研究结论
1.Pax2阳性细胞的单细胞转录组图谱为研究早期肾脏发育过程中细胞的异质性，作者对FACS筛选的E9.5时期Pax2阳性细胞进行Sc-RNA测序，共获得个细胞，分为7个细胞亚群，分别注释为ND，MT，intermediate，mesoderm，tailbud，hindgut，pharyngealectoderm和neural。其中ND细胞个，中肾小管细胞个。ND，MT，intermediatemesoderm和tailbud四个细胞群Top基因的表达结果显示出中胚层来源的细胞群体之间有谱系关系，并明确了肾细胞群体，以进行下一步研究。
图2：Pax2-GFP阳性细胞的单细胞RNA测序图谱及分群鉴定2.肾原基具有明显的祖细胞群作者将ND细胞群分为4个细胞亚群，命名为导管祖细胞1（NdPr1），NdPr2a/b，NdPr3和NdPr4。NdPr1亚群表达转录因子（Pax8，HoxA/B/Cgenes，Cited2，Uncx），和信号分子（Sfrp2，Pcp4和Fgf8）相关基因。作者进一步将E9.5时期的ND组织沿rostro-caudalaxis分成4个区域Rostral，IntermediateI，IntermediateII和Tip，在ND延伸的过程中，这些区域表现出不同的形态和行为。免疫组化结果显示NdPr1细胞位于ND的前端（RostralandIntermediateI）。比较E8.75和E9.5胚胎时期结果显示Hoxb9在早期前/中肾（E8.75）中的表达，随着发育时期的延长，在E9.5时期中表达减弱。
图3：输尿管中的祖细胞NdPr2细胞亚群主要以NdPr1markers的下调和Tfap2b转录因子的上调为特征。根据Sfrp2的下调表达和Tfap2b的上调表达，该亚群可以分为两个群体（NdPr2a和NdPr2b），Tfap2b抗体的组织学染色结果表明该区域的表达仅限于ND的前端和中间区，而不在ND的顶区和中肾小管细胞。Tfap2a则表现出和Tfap2b一样的模式。时间序列研究表明Tfap2b基因的表达起始于E9.0时期，并且保持在E9.5时期的前端。NdPr3细胞亚群以Tfap2b及信号分子相关基因Jag1，Notch2，Spry2表达为特征。该亚群在ND细胞群的MT区域富集。在E10时期，Jag1，Notch2和Kdelr2在ND和中肾小管细胞之间的中肾连接片段（CnS）中表达。NdPr4细胞亚群以NdPr1，NdPr2和NdPr3亚群marker基因（Hoxb9和Tfap2b）下调及Aldh1a3和Wnt6的上调表达为特征。该亚群的GO生物学途径富集最多的为UB形态学。时空分析表明，NdPr4是ND中出现的最后一个细胞群，从E9.5开始在蛋白水平上检测到。同理，中肾小管细胞群可以分为3个细胞亚群，分别为MtPr1，MtPr2和MtPr3。MtPr1细胞亚群表达Lhx1，Fgf8和Wnt4，相当于MT的上皮，与后肾的逗号状形体相当。MtPr2高表达中间中胚层标记物Osr1以及波形蛋白（Vim），可能代表中间中胚层和中胚肾小管之间的过渡阶段。MtPr3则表现出与NdPr3相似的基因表达模式。这个谱系可能代表中枢神经系统的祖先。综上所述，这些结果鉴定了肾原基中的ND和中肾小管谱系中明显的祖细胞群。3.Cluster-RNA-seq支持NdPr的空间分割。
以上NdPr1-NdPr4在E9.5时期的表达模式表明ND在沿rostro-caudal轴延伸的过程中，细胞谱系存在空间分割。为了评估不同细胞群体的空间异质性，作者利用ClusterRNA测序策略（cl-RNA-seq）得到了均值为6个细胞的细胞群（Cl-a到Cl-f），代表4种主要的ND细胞类群。Pearson相关分析发现Cl-a、Cl-b和Cl-d分别与NdPr4、NdPr1和Ndpr3有关，而Cl-c，Cl-e和Cl-f和NdPr混合（NdPr1/2;NdPr2/3和NdPr2/4）。图4：Cluster-RNA-seq分析支持肾小管祖细胞的空间分离细胞数据聚类表明NdPr2细胞可以邻近所有的ND祖细胞类型，因此提示NdPr2细胞在NdPr进程中处于中心位置。相反，NdPr1和NdPr3从未在物理上接近NdPr4。进一步，作者通过10xVisum空间转录组技术得到了E9.5时期ND组织切片的空间转录组信息。ND前端区域的转录组信息显示了NdPr1，NdPr2和NdPr3的富集，而不是NdPr4。总的来说，这些结果表明，NdPr细胞群沿ND的rostro-caudal轴有明确的组织结构。
4.NdPr前体细胞的出现时间为了特异性地解决NdPr细胞群体的时间序列问题，作者选择E8.75，E9.0，E9.5和E11.5ND/UB发育时期的肾脏细胞进行Sc-RNA测序。结果表明，前中间层和NdPr1markerOsr1和Pcp4在E8.75和E9.0时期ND细胞中均有富集。NdPr1在早期阶段占ND细胞总数的80%以上，在后期逐渐减少。而一些NdPr1marker如Sfrp2已经在E8.5胚胎的前中胚层中表达，这些结果支持NdPr1细胞代表前中胚层和NdPr2ND细胞之间的过渡状态。NdPr2细胞在E9.0时首次出现，在E9.5时期明显积累，几乎占了ND细胞的一半。少量的Ndpr3细胞在E9.0时期鉴定到，但是在E9.5时期，该类细胞更丰富。最后，NdPr4仅在E9.5时出现，占细胞总数的11%。NdPr4是最接近E11.5时期UB细胞的ND细胞类型。Aldh1a3（NdPr4）和Tfap2b（NdPr2）全免疫染色的结果也得到类似结果。
图5：移植实验和Sc-RNA测序分析肾小管前体细胞的发育轨迹作者进一步将连续发展阶段的ND细胞的进行拟时间分析的结果表明：在ND发育过程中，NdPr1-4细胞群体以时间序列的方式出现。进一步的组织移植实验也证实了NdPr2细胞的双重特性支持尿路原基中ND祖细胞类型的时间序列发展。5.Gata3调节肾导管前体细胞的进展
Gata3的生殖系失活导致ND延长缺陷，引起最终肾的缺失。Gata3基因敲除的胚胎在E9.5时期伸长率下降了40%。在E10.5时期，Gata3突变体NDs形状不规则，每段导管内腔大小和细胞数量均增加，且一些ND细胞脱离了突变体的导管。这些细胞失去了典型的上皮形态，表现出上皮标志物E-cadherin和顶端Par复合蛋白aPKC的异常表达。图6：Gata3缺陷型肾小管NdPr4缺乏且在NdPr1-2期被阻滞接下来，作者将Pax2-GFP阳性细胞及E9.5时期的Gata3突变胚细胞进行了单细胞测序，共获得个Pax2-GFP细胞及个Gata3突变细胞。Control和Gata3突变胚中分别有个细胞和个细胞被鉴定为ND细胞。将ND细胞重新进行了聚类分析，control胚胎可分为NdPr1、NdPr2、NdPr3和NdPr4四个细胞亚群，而Gata3突变体细胞在NdPr2簇中很少，在NdPr4簇中完全缺失。对control和Gata3突变簇中表达最显著的基因进行分析，证实了ndpr4基因标记的缺失，免疫组化也得到类似结果。拟时间轨迹分析证实，Gata3突变细胞未能转变为NdPr4命运。总的来说，这些结果支持Gata3在NdPr2细胞中下调NdPr1命运中的作用，并对NdPr4命运的规范提出了严格的要求。
6.Tfap2a/2b在ND形态发生和谱系进展中的作用NdPr2细胞群以Tfap2b的表达为特征，作者假设Tfap2家族成员可能是这种细胞类型的调节因子。Sc-RNA测序数据表明，Tfap2a和Tfap2b在ND中均有表达，且表达模式相似，而其它Tfap2成员的表达不明显。这提高了两个基因之间功能冗余的可能性。
图7：Tfap2a和Tfap2b的失活导致肾小管形态发生和前体细胞特性的缺陷作者进而利用CRISPR/Cas9基因编辑技术得到了Tfap2a；Tfap2b双突变的胚胎。Tfap2a单个或复合Tfap2a-/-；Tfap2b+/-基因敲除胚胎未显示明显的ND表型。而85%的复合Tfap2b基因敲除胚胎在E10.5时期表现出严重的ND完整性缺陷。Pax2-GFP荧光显示双基因敲除胚胎存在严重的肾脏缺陷，在E9.5时期的ND较短且较宽。与对照相比，E9.5时期Tfap2a/2b双突变体的ND长度显著降低20%。这种延伸缺陷在其它Tfap2a/2b双突变体中也得到了证实。在Tfap2a/2b突变体NDs的前端区，Gata3+细胞数量增加，这与GFP荧光显示的ND宽度增加一致。这个结果进一步表明，在ND中Gata3基因表达不需要Tfap2a/b。总之，这些结果确定Tfap2a和Tfap2b作为ND形态发生的调节因子在进化过程中通过降低中胚层细胞的特性协同调控推动向NdPr2的过渡。
结论
综上所述，本研究利用单细胞测序技术构建了不同时期胚胎肾脏的单细胞图谱，结合10xVisium空间转录组及免疫组化技术及解析了祖细胞状态的协同进展在泌尿道发育过程中的作用，研究认为ND/UB谱系前体是由四个主要的肾导管祖细胞群体顺序产生的，Gata3和Tfap2a/2b为起始泌尿道发育的前体细胞进展的关键调节因子，为进一步研究肾脏疾病的发生、发展及治疗提供了理论依据。
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